秘籍：慢病毒包装的终极指南——实验方法+技术答疑
The Ultimate Guide
对于刚刚接触慢病毒包装的新手来说，常常会遇到一些疑问。为了帮助大家快速入门，小编精心总结了10个最常见的问题。
01
慢病毒安全吗，会感染人吗？
慢病毒是基于HIV-1改造的，通过去除编码病毒复制必需的基因，使其自身无法复制并产生有感染性的子代病毒，从而大大降低了引发类似天然病毒所致疾病的可能性。尽管如此，慢病毒本身仍存在一定的生物安全风险。但是，通过恰当的处理和遵循严格的安全规范，可以在可控范围内进行相关研究和应用。
02
包装慢病毒用什么细胞？
慢病毒包装通常使用的细胞是HEK293T细胞，也有人推荐HEK293FT。细胞状态对于慢病毒包装至关重要，因此，用于慢病毒包装的HEK293T细胞的传代数不宜过高。通常建议使用的HEK293T细胞在第6代左右，不超过10代。
03
PEI转染试剂，阳离子脂质体转染试剂，我该怎么选择？
脂质体类转染试剂：转染效率相对较高，操作相对简便，可能存在一定的细胞毒性。这里给大家推荐世途科生物的脂质体传染试剂NanoTrans™ Transfection Reagent Plus (#CT0005)。
聚乙烯亚胺（PEI）：这是一种常用的阳离子聚合物转染试剂，成本效益较好，在大规模慢病毒包装或需要控制成本的应用场景中具有一定优势。这里给大家推荐CytoPEI ™ Transfection Reagent（液体）(#CT0002)和Linear Polyethylenimine Hydrochloride (MW 40,000)（粉末） (#CT0009)。
钙磷酸盐转染试剂：是一种成本低廉的传统转染方法。其转染效率通常低于脂质体和PEI，需要通过优化操作，可以提高其在慢病毒包装中的有效性。
04
慢病毒包装步骤
好了，到了大家最期待的环节。以6cm为例，我会详细说明实验步骤，并精确到每一步的时间点。你可以先按照这个时间点进行一次实验，然后根据自己的需要进行调整。
DAY 1 (1:00 PM)
铺板HEK 293T细胞
复苏的细胞传代至稳定状态（通常需要传代三次）后，铺板至6cm培养皿。第二天转染时，细胞密度应达到90%，并且细胞应尽量铺展均匀。
DAY 2 (1:00 PM)
在培养箱中恢复细胞状态约24小时后，观察细胞状态和密度是否符合要求，然后准备进行转染。
三质粒转染体系中三种质粒的配比有多种方式，但基本相似。小编推荐使用3:2:5的比例，即pSPAX2、pMD2.G和PKLV2（载有目的基因的质粒）
1) 一般而言，对于6cm dish，总转染量为10μg质粒，使用的PEI量是质粒量的3倍，即30μL。按照比例计算，pSPAX2、pMD2.G和PKLV2的质量比应为3μg：2μg：5μg。取总质量为10μg的质粒加入到100μL的无血清无双抗培养基中，使用移液枪混匀15次以上。
2) 取PEI(一般配置成1mg/mL) 30μL加入到100μL的无血清无双抗培养基中，移液枪混匀15次以上；
3) 将PEI稀释液逐滴滴加到质粒DNA稀释液中，移液枪轻柔混匀15次以上，室温静置10-15min，形成DNA-PEI转染试剂复合物；
4) 在形成复合物的过程中，需要移除细胞生长培养基，并在每孔中加入2mL新鲜预热的完全培养基。将DNA-PEI转染试剂复合物缓缓滴加到293T细胞中，随后轻轻混匀，在培养箱中进行培养。
DAY 2 (6:30 PM)
换液
转染后6小时，将含有转染试剂的培养基上清更换为3mL DMEM完全培养基。注意，在更换培养基时要轻柔操作，避免吹散细胞。
DAY 4 (6:30 PM)
收病毒
在转染后的48-72h，为病毒生产的高峰期，一般我们收集转染后48h（换液后）的病毒液用于实验（如果带有荧光蛋白可以显微镜下看一下转染效率），足以满足大部分实验需求。
收集病毒于15mL 离心管中，500g，5min离心去细胞碎片和杂质，随后使用注射器和0.45μm滤器进行过滤。收集后的病毒上清可以用来进行细胞感染和低温储存。
病毒储存
过滤后的病毒液氮中速冻后存于-80℃冰箱保存，每次冻融会损失一部分的病毒颗粒，因此冻存前按需分装好，避免反复冻融。也可以暂时存放于4℃冰箱，存放2-3天，病毒滴度不会有很明显的变化。
DAY 4 (7:00 PM)
病毒感染
准备细胞：细胞培养至对数生长期后进行铺板（在构建稳转细胞系时，一般使用6孔板进行铺板），在贴壁细胞进行病毒感染时，细胞的最佳融合度为70%左右。
准备病毒：4°C保存的病毒，取出后用移液器轻轻混匀；-80℃保存的病毒，取出后在冰上融化后使用。
感染细胞：感染细胞时，首先观察细胞生长状态，因为细胞状态对感染效率影响较大。吸去原有培养基，并更换为新鲜培养基。根据实验设计吸取准确体积的病毒液加入细胞，将病毒液和培养基混匀（例如，如果是6孔板感染，可以使用1mL病毒液+1mL培养基），然后放入培养箱培养。对于难感染的细胞，也可以使用病毒增强剂如Polybrene等来提高感染效率。
换液：加入病毒后8-24小时（一般选择感染过夜），弃去含病毒的培养液，然后换上新鲜完全培养液，继续在培养箱中培养。如果病毒载体带有荧光蛋白，感染后48小时可以通过荧光显微镜观察感染效率。对于携带puromycin等抗性基因的病毒，换上含适当浓度puromycin的完全培养液，筛选出稳定表达的细胞株。
05
病毒需要浓缩吗？
这取决于细胞的感染难易程度。如果细胞容易感染或对感染效率的要求不高，则无需对病毒进行浓缩。如果细胞难以感染或对感染效率有较高要求，则需要对病毒进行浓缩。特别是在原代细胞等难感染的细胞，通过提高MOI可以有效提高病毒的感染效率。
06
需要做滴度检测吗？
不需要：这也取决于实验目的，如果包装的病毒是用来做过表达编码基因或者敲除、敲低细胞系，其实没有必要进行精确的滴度测定。我们可以通过观察质粒转染效率来大致判断病毒包装情况（质粒带有荧光标记蛋白），转染效率越高，病毒的产毒效率也越高，效率只需满足实验需求即可。构建稳定转染细胞系，还需要使用抗生素或者流式的方法筛选阳性细胞，因此，即使最初感染时的效率不高也无妨。
需要：如果想要准确测定病毒的滴度，例如在进行RNAi-screening或CRISPR-screening时使用慢病毒，由于需要严格控制感染复数，就需要准确测定慢病毒的滴度。
07
什么是病毒滴度？
病毒滴度的单位是：TU/mL代表每毫升病毒液中具有转导功能的病毒颗粒的数目，计算公式为：
这里需要说明的是，感染时的细胞数指的是病毒液感染目的细胞时的细胞数，而不是接种时的细胞数。具有转导功能意味着该病毒颗粒能够整合到靶细胞的基因组中。
08
如何检测病毒滴度？
快速方法：市面上可以找到很多商品化的试剂盒，这些方案各有优劣，但基本上都有这样一个规律：越准确，就越花时间。越省事的，就越不准确。本质上是测定病毒p24外壳蛋白量的方法，相比传统的ELISA法来说，可要方便不少。
准确测定法：快速测定法之所以不准确，是因为它们没有考虑慢病毒的活性。也就是说，即使死病毒也会被测出来。对于荧光蛋白的慢病毒来说，可以准确测出其病毒滴度，大致步骤如下：（1）将8×105 293T细胞铺在12孔板中，可以在细胞未完全贴壁时直接将收集的病毒液按照0、5、10、15、20μL加入；（2）贴壁后换液；（3）感染48小时后，通过流式检测阳性细胞比例，即可换算出病毒滴度；（4）病毒滴度计算：如果是将8×105细胞加入24孔板并加入5μL病毒液进行感染，感染效率为30%（一般取感染效率在25-50%之间的孔来计算），病毒滴度为：
09
稳转和瞬转有什么区别？
瞬转（瞬时转染）：是将外源基因导入到细胞内，以实现目的基因的暂时但高水平表达。在瞬时转染过程中，转染的DNA没有整合到宿主染色体上，因此随着细胞的分裂增殖，外源基因最终会丢失。瞬时转染更简单且不那么费力，可以使用DNA或RNA进行。
稳转（稳定转染）：是指将外源基因整合到宿主细胞基因组中，使得这些基因能随细胞增殖稳定遗传。稳定转染过程更为繁琐，需要使用选择性标记或抗生素，适用于需要生成克隆细胞系的情况，能够持续过表达或抑制特定基因的细胞系。
10
什么样的实验需要用包病毒来做？什么情况下转染质粒就可以完成？
基因整合能力：（1）慢病毒可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，外源基因随着细胞分裂传递至子代细胞中。因此，慢病毒感染适用于需要长期、稳定表达外源基因的实验场景。由于每个细胞中只整合了1-2个DNA拷贝，所以表达水平较低。稳定转染的转染效率只有瞬时转染的1-10％。（2）转染的质粒DNA没有整合到宿主基因组中，所以外源DNA在后续的细胞有丝分裂阶段将丢失或被稀释掉。外源基因的表达是短暂的（最长7-10天），但表达水平很高，因为在同一个细胞里会有多个拷贝的DNA。
广泛的宿主范围：慢病毒可以感染分裂和非分裂的细胞，几乎可以感染所有类型的细胞，包括原代细胞、神经元细胞、干细胞等难以转染的细胞类型。而质粒转染则适用于快速、瞬时的基因表达分析。选择哪种方法取决于实验的具体需求和目的。
公司介绍
上海世途科生物（CYTOCH）是一家生命科学上游工具类企业，聚焦细胞培养、功能检测与流式检测等产品和技术的开发。
公司现已具有转染化合物骨架开发与筛选评价技术、抗体荧光标记技术和荧光探针开发技术等三大技术平台。团队坚信化学技术的进步能为生命科学研究提供更多的可能性，使相关实验结果更为灵敏、准确。
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