siRNA转染后细胞检测时机与药物处理优化

RNA干扰(RNA interference, RNAi) 是真核生物中高度保守的，由小分子干扰RNA (small interfering RNA, siRNA) 介导的转录后基因沉默现象，在基因功能的研究中得到了非常广泛的应用，siRNA转染后的细胞处理及检测时机选择是实验成功的关键。现基于siRNA作用原理，系统梳理转染后细胞检测的时间窗口、药物处理流程及试剂选择建议，帮助实验人员优化实验设计，获得优异的结果。

siRNA的作用原理：

Pharmaceuticals 2022

真核细胞中通过不同途径利用小干扰核糖核酸（siRNA）实现基因沉默的机制 ：通过内源性途径，长前体（即双链核糖核酸（dsRNA）或短发夹核糖核酸（shRNA））会被 DICER 酶切割成成熟的siRNA（1a）。通过外源性途径，合成的 siRNA 会通过内体进入囊泡，并释放到细胞质中（1b）。随后由 AGO 蛋白进行链分离（2），其中 passenger链会被切割（3），而 guide（引导）链会被 RNA 诱导沉默复合体（RISC）选中，作为与信使核糖核酸（mRNA）配对的模板（4）。接着 Ago 利用其核酸内切酶活性切割与siRNA 完全互补配对的靶RNA，产生的RNA片段易受到5′或3′核酸外切酶的攻击而快速降解，从而在转录后水平沉默靶基因的表达（5）。

siRNA转染&药物处理时间节点：

转染阶段

1）siRNA通过脂质体递送进入细胞质（4-6小时），细胞内吞过程时间很短，因此一般无需长时间将细胞置于转染培养基中，但对于难转染细胞可延长至12小时以确保效果。

2）4-12小时后更换新鲜培养基（需根据细胞类型优化）。

检测阶段

1）转录水平检测：转染后24-48小时采集细胞，通过qPCR验证mRNA敲低效率。

2）蛋白水平检测：转染后48-72小时收样（Western Blot或ELISA检测），因为siRNA仅通过降解靶mRNA阻断新蛋白的合成，而细胞中已存在的旧蛋白需依赖蛋白酶体等内源性降解系统逐步清除。不同靶蛋白的半衰期差异较大（如短半衰期蛋白降解快，长半衰期蛋白需更久）。siRNA的基因沉默作用具有时间依赖性，转染72小时后，外源siRNA逐渐被细胞内核酸酶降解或稀释，导致对mRNA的抑制能力下降，新蛋白重新合成。旧蛋白经降解后，若新蛋白恢复合成，则总蛋白水平会缓慢回升，形成“沉默效应窗口期”。首次进行siRNA干扰效果不佳时，建议多点测定，确定最佳测定时间点。

药物处理与分析

1）加药时间：转染后48小时引入药物（需确保siRNA已生效）。

2）处理时长：药物作用24小时后收样分析（总时间：转染后72小时）。

3）注意事项：siRNA抑制效果在72-96小时后逐渐减弱，建议全程监控转染效率（推荐预实验测试多个时间点）。

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部分客户反馈siRNA转染反馈结果：

客户使用CT0006转染HONE-1和SUNE-1鼻咽癌细胞，转染的siRNA。

客户使用CT0006转染RAW264.7小鼠单核巨噬细胞白，转染的siRNA。

客户使用我们的免疫细胞转染试剂转染小鼠原代巨噬细胞，转染的siRNA.和竞品转染试剂相比，靶基因敲低效率明显。

客户使用CT0010转染BMDM小鼠骨髓源性巨噬细胞，转染的siRNA。

客户使用CT0010转染143B和293T细胞，转染的siRNA。

参考资料：

[1]. Biotechnological Evolution of siRNA Molecules: From Bench Tool to the Refined Drug. Pharmaceuticals (Basel). 2022 May.